Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路与肿瘤的发生密切相关，该通路中激酶表达上调或因突变而引起的自激活会使细胞异常增殖、分化，进而导致肿瘤发生。Raf激酶作为该通路中Ras信号的下游效应器发挥着至关重要的作用。虽然DFG-in构象的选择性BRafV600E抑制剂Vemurafenib已被证实在临床上对BRafV600E表型的黑色素瘤有效，但MAPK通路在3–6个月后的再次异常活化导致了获得性耐药。同时，结肠癌虽为BRafV600E表型，但对Vemurafenib显示固有性耐药。Vemurafenib甚至激活BRafWT表型黑色素瘤中的MAPK通路，在移植瘤模型中增强肿瘤生长。通过分析耐药性产生的作用机制，明确DFG-out构象的Pan-Raf抑制剂可有效避免BRafWT或CRaf异常激活所导致的耐药性，在BRafWT表型的黑色素瘤动物模型中抑制肿瘤增殖。先导化合物I-01的激酶谱显示了其对Pan-Raf和RTK的强效抑制活性。作为DFG-out构象的多靶点激酶抑制剂，I-01同时靶向通路中的多个节点在增强抑制效力的同时避免了由修复或代偿机制诱导的耐药性。基于I-01的结合模式，设计并合成了基于嘌呤、吡咯[2,3-d]嘧啶和嘧啶结构的三个系列的衍生物，经构效关系分析，选取I-15、II-12和III-41作为代表性化合物。I-15对BRafV600E、ARaf、BRafWT和CRaf原聚体的IC50值分别为3.5 nM、8.9 nM、5. 8 nM和1.7 nM，优于对照Vemurafenib(对CRaf原聚体的IC50值为135.8 nM)。作为强效的Pan-Raf抑制剂，I-15对HepG2，SW579，MV4-11，COLO205和SK-MEL-2细胞株的抗增殖活性与阳性对照Sorafenib和Vemurafenib相当。I-15的WB实验结果说明，系列I化合物通过抑制MAPK通路抑制A375和SK-MEL-2细胞的增殖。在BRafWT表型的SK-MEL-2细胞株中，抑制ERK的磷酸化，避免了获得性耐药的发生。I-15作为多靶点激酶抑制剂，具有克服耐药性的潜力。II-12对Pan-Raf的抑制效力与I-15相当，对不同细胞株的抗增殖活性较I-15有所提高。对Vemurafenib显示固有性耐药和获得性耐药的HT-29和SK-MEL-2细胞株显示出优于阳性对照的抗增殖活性，IC50值分别为2.19 μM和0.41 μM，对其它BRafWT和BRafV600E异常表达细胞株的抑制活性也与阳性对照相当。III-41对Pan-Raf的抑制效力与I-15相当，对不同细胞株的抗增殖活性较II-12有所提高。对耐药性细胞株COLO-205和SK-MEL-2显示出优于阳性对照的抗增殖活性，IC50值分别为0.75 μM和0.36 μM。III-41的溶解度由II-12的0.107 mg/mL提高至0.213 mg/mL，溶解度的改善有益于提高细胞抗增殖活性。III-39对NCI细胞谱中的57株癌细胞均显示个位μM的IC50值，且虽为多靶点激酶抑制剂，但无细胞毒性(LC50>100 μM)。Raf二聚体抑制效力、耐药细胞株抗增殖活性和WB测试结果显示，III-41可克服Vemurafenib所显示和诱导产生的固有/获得性耐药。III-41在大鼠的体内代谢中也显示了良好的药代动力学参数，口服生物利用度达44%，具有成药性，为体内药效学测试提供了候选化合物。