•非天然氨基酸是多肽、类肽以及许多药物分子的重要组成单元，也是合成手性药物、手性农药等的关键中间体，作为手性配体或砌块被广泛应用于不对称催化和有机合成中。 •L-叔亮氨酸(L-Tle)是一种非天然氨基酸，由于其叔丁基空间结构上的特殊性，使其具有一些特殊性质，而被广泛应用于抗肿瘤试剂、HIV蛋白酶抑制剂等药物生产中。 •本技术利用亮氨酸脱氢酶不对称还原生物法制备L-叔亮氨酸具有操作简单，反应条件温和，转化效率高，光学纯度高（99%以上），浓度底物高等特点。通过双酶共表达和辅酶合成羟化等策略，构建零辅酶添加反应体系，底物浓度1 mol/L时 1 h内完全转化，时空产率达到3144 g/(L·d)，为目前报道最高水平。项目已经完成2M3规模中试，成本降低40%。