轮状病毒(rotavirus， RV) 是各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一， RV基因由11个不连续的dsRNA节段组成，其平均长度约为660～3300bp，分别编码6个结构蛋白（VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7）和5个非结构蛋白（NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5）。RV在电镜下呈球形，无囊膜，由内向外拥有核衣壳、内衣壳、外衣壳三层蛋白质衣壳。根据RV群抗原的不同及病毒RNA末端指纹图谱的分析，可将该病毒共分为A～G七个群；根据其中和抗原VP7的差异可将A组RV分为14个G型（G1～G14）及21个P型（P1～P24）。轮状病毒性腹泻是一种急性肠道传染病，发病率达30%-80%，病死率可达50%。本病的重点在于免疫预防，然而，到目前为止尚未有动物轮状病毒可靠疫苗，尚无有效手段。而且由于不同地区轮状病毒分型不同，病毒高度变异，对于BRV的预防控制，目前尚无有效手段。而且由于不同地区轮状病毒分型不同，病毒高度变异，因此研制RV快速检测技术十分紧迫和必要。该成果包括两项技术：轮状病毒的细胞培养技术和实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒。该成果历经12年完成，是国家民委重点科研项目（编号：MW2002ZD010）；甘肃省科技支撑计划项目（编号：0708NKCA079；1104NKCA168），甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（编号：GNSW-2010-10)）及兰州市城关区科技计划项目（项目编号2011-6-4）的集成。研究成果通过甘肃省科技厅和农牧厅组织的鉴定验收，经成果查新，专家们一致认为达到国内领先水平。成果获得2014年度甘肃省科学技术进步奖二等奖。一、轮状病毒的细胞培养技术该项技术包括以下步骤：以10%小牛血清加高糖DMEM作为细胞生长液，将轮状病毒腹泻病人或动物粪便标本用1×PBS(0.1M)制成悬液，经50μg/mL胰酶在37℃下作用后接种于MA-104罗猴肾细胞，在37℃下吸附1h；以及加含胰酶（无血清）的DMEM细胞培养液，37℃培养3～4天，CPE达到90%时收获细胞培养液，冻融2次，作为下一代培养的接种物培养传代。该方法可适用于人或动物，通过对粪便标本的多次培养，效果可靠，重复性良好。该成果已获得发明专利授权（ZL 201010563967.2）.二、BRV实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒根据Genbank牛轮状病毒VP4和VP7基因，分别设计了VP4 VP4和VP7基因的特异性引物，建立了EvaGreen荧光定量RT-PCR(qPCR)检测方法，研发出了实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒。检测试剂盒由VP7基因保守序列特异性引物、特异性荧光探针、逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）等成分组成，运用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测，样本稀释度达10-5～10-4，定量检测线性范围达10-1拷贝／μＬ，对其它病毒核酸、细菌和阴性对照无任何扩增，特异性强；以及包括样品的采集与处理、病毒RNA的提取、特异性引物的设计、RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等操作方法及结果判定，本试剂盒具有快速、敏感、特异的特点，降低了检测成本和时间，省时省力，可用于粪便和血液等多种样本中轮状病毒的定量检测,以及适用于 BVDV 的检测、诊断和流行病学调查。检测快速、敏感、特异，可在4个小时内获得结果。经在甘肃省多地近万头（份）临床样本试用，大幅提高了该病的诊断准确率，明显减少了腹泻性疾病造成的经济损失。三、使用说明本检测试剂盒可检测50头份，保存期6个月。内附样品制备方法、操作步骤、结果判定标准、使用说明书及注意事项。